Was ist Chromatographie? 

Chromatographie ist eine Technik, mit Hilfe derer die verschiedenen Substanzen eines komplexen Stoffgemisches voneinander getrennt werden können. Dies ermöglicht zum einen die Identifizierung von einzelnen Substanzen (qualitative Analyse). Zum anderen kann durch eine chromatographische Trennung eine Gehaltsbestimmung der unterschiedlichen Substanzen durchgeführt werden (quantitative Analyse). [1-4] 

Warum ist die Chromatographie für mich wichtig? 

Die Chromatographie ist eine der am häufigsten verwendeten chemischen Analysetechniken. Sie wird für die unterschiedlichsten Fragestellungen angewendet. Zum Beispiel werden mit Hilfe der Chromatographie Lebensmittel und Gewässer auf toxische Substanzen untersucht. Des Weiteren können Umweltverschmutzungen in Luft, Wasser und Boden nachgewiesen werden. Neben der Analyse von Umwelt- und Lebensmittelproben, wird die Chromatographie ebenfalls in der (chemischen) Produktion für die Qualitätskontrolle von Ausgangsstoffen und Produkten angewendet. 

Mit Chromatographie lassen sich somit viele analytische Fragestellungen lösen – vielleicht auch einige von Ihren? 

Wie funktioniert die Trennung? 

Die Trennung der verschiedenen Substanzen eines komplexen Stoffgemisches (= Probe) erfolgt in der Säule des Chromatographiesystems. Die Probe wird mit Hilfe der mobilen Phase durch die Säule, welche die stationäre Phase enthält, transportiert. Beim Durchfluss durch die Säule kommt es zu Wechselwirkungen zwischen den Analyten und der stationären Phase. Dies bewirkt ein Zurückhalten der Analyten (= Retention), so dass diese die Säule zeitverzögert verlassen (= eluieren). Wie stark und wie lange die Analyten mit der stationären Phase wechselwirken, ist von den chemisch-physikalischen Eigenschaften der Analyten und der stationären Phase abhängig. Verschiedene Analyten werden unterschiedlich stark retardiert, wodurch es zu einer Trennung der verschiedenen Substanzen eines komplexen Gemisches kommt. 

Die bekanntesten und am häufigsten verwendeten chromatographischen Analysemethoden sind die Hochleistungsflüssigchromatographie (kurz HPLC) und die Gaschromatographie (kurz GC). Beide unterscheiden sich u.a. durch die verwendete mobile und stationäre Phase. Bei der GC werden (inerte) Trägergase, wie z.B. Helium oder Wasserstoff als mobile Phase verwendet. Die stationäre Phase befindet sich bei der GC als Film an der Innenseite der Säule, welche üblicherweise zwischen 15 und 60 m lang ist und einen Innendurchmesser zwischen 0,1 und 0,7 mm aufweist.  

Hingegen werden bei der HPLC flüssige, organische Lösungsmittel als mobile Phase verwendet. Die stationäre Phase sind oberflächenmodifizierte sphärische Partikel, welche sich in der zylindrischen Säule befinden. Typischerweise ist die Säulen 50 – 150 mm lang und der Innendurchmesser beträgt 2 – 5 mm. [1-6] 

Was muss ich noch über die GC & HPLC wissen? 

Mittels der GC können Substanzen analysiert werden, welche sich unzersetzt in die Gasphase überführen lassen. In der Regel wird während des Analysenlaufs die Ofentemperatur kontinuierlich und kontrolliert erhöht (Gradientenelution), so dass z.B. auch Proben analysiert werden können, die Analyten mit stark unterschiedlichen Siedepunkten bzw. Dampfdrücken enthalten. Ursächlich für die Trennung von Substanzen bei der GC ist zum einen die Wechselwirkung zwischen Analyt und stationärer Phase und zum anderen der Dampfdruck (oft wird hier der Siedepunkt verwendet) der Analyten. 

Mittels der HPLC werden klassischerweise Substanzen bzw. Extrakte analysiert, welche in organischen Lösungsmitteln gelöst sind. Um eine möglichst optimale Trennung von einer Vielzahl an Analyten zu gewährleisten, wird die Zusammensetzung der mobilen Phase im Laufe der chromatographischen Trennung typischerweise verändert (Gradientenelution). Normalerweise stehen zwei oder vier Lösungsmittel oder Mischungen zur Verfügung, die mittels binärer oder quaternärer Pumpen gefördert werden. Im Gegensatz zur GC ist bei der LC hauptsächlich die Wechselwirkung zwischen Analyt und stationärer Phase sowie die Löslichkeit der Analyten in der mobilen Phase ursächlich für die chromatographische Trennung. [2-6] 

Wie werden die getrennten Substanzen detektiert? 

Für die Detektion der eluierenden Analyten gibt es verschiedene Detektoren. Bei der HPLC wird zum Beispiel häufig ein Diodenarray-Detektor (DAD) und bei der GC ein Flammenionisationsdetektor (FID) verwendet. Heutzutage findet im Vergleich zu den anderen Detektoren das Massenspektrometer (MS) immer mehr Anwendung. Sie können das MS u.a. dann einsetzen, wenn Sie nicht genau wissen, welche Substanzen in Ihrer Probe vorhanden sind oder wenn Sie sehr niedrige Nachweis- und Bestimmungsgrenzen erreichen müssen. Massenspektrometer sind sowohl für die Kopplung mit einem GC als auch mit einem LC erhältlich. Das Funktionsprinzip des Massenspektrometers, ist für beide Kopplungen sehr ähnlich. Zunächst werden die aus dem Chromatographiesystem eluierenden Substanzen ionisiert. Die dadurch entstehenden Molekülionen werden durch elektrische Felder in den Massenanalysator überführt. In dem Massenanalysator werden die Molekülionen nach dem Masse-zu-Ladungsverhältnis (m/z) getrennt und nach dem Massenanalysator in ein elektrisches Signal umgewandelt, so dass sie detektiert und aufgezeichnet werden können. Der detaillierte Aufbau von Massenspektrometern ist, je nach Kopplungstechnik, unterschiedlich. Bei einem MS, welches an ein GC gekoppelt wird, werden die eluierenden Moleküle i.d.R. im Hochvakuum mit einem Elektronenstrahl beschossen. Hierdurch wird nicht nur ein Elektron aus dem Molekül entfernt, sondern die überschüssige Energie führt zu einer Fragmentierung des Molekülions in sogenannte Fragmentionen mit niedrigerer Masse. Die Identifizierung der Analyten erfolgt meistens nicht mittels des m/z-Verhältnis des Molekülions, da dieses zum Teil nicht mehr im Massenspektrum erkennbar ist. Die Fragmentierung ist allerdings sehr reproduzierbar, so dass Datenbanken zur Identifizierung verwendet werden. Die Übereinstimmung zwischen gemessenen Massenspektrum und dem Massenspektrum der Datenbank, wird häufig als ein Identifikationsparameter verwendet. Bei Massenspektrometern für die LC findet die Ionisierung nicht im Vakuum sondern unter Atmosphärendruck statt. Neben der Ionisierung findet in der Ionenquelle ebenfalls die Verdampfung der mobilen Phase (Lösungsmittel) statt. [2-4,7] 

Wer hat die Chromatographie entdeckt? 

Die Technik der Chromatographie wurde im Jahr 1906 zum ersten mal durch den russischen Botaniker Mikhail Semjonowitsch Tswet publiziert. [8] Tswet verwendete diese Technik zur Trennung von Pflanzenpigmenten, z.B. Chlorophyll. Dazu verwendet er ein Glasrohr, welches mit pulverisierter Kreide und/oder Aluminiumoxid gefüllt war. Durch Zugabe von Lösungsmittel und unter der Einwirkung der Schwerkraft bewegten sich die Pigmente entlang der Säule nach unten und trennten sich dabei auf. Dies führte dazu, dass Tswet unterschiedliche Farbränder entlang der Säule beobachtete. Aufgrund der unterschiedlichen Farbränder gab Tswet dieser Technik den Namen Chromatographie. Der Begriff Chromatographie setzt sich aus dem griechischen Wort „chroma“ für Farbe und „graphein“ für Schreiben zusammen. [1,8] 

Wenn ich eine Tafel Schokolade analysieren möchte, wie bekomme ich diese in das Analysesystem? 

Eine Tafel Schokolade kann, wie sie sich vorstellen können, nicht einfach in das Analysensystem gegeben werden. Ähnlich wie andere Proben, zum Beispiel Kaffee, Tee oder Gewürze, muss im Vorhinein eine Probenvorbereitung durchgeführt werden. Die Vorbereitung, bis die Probe in einer analysierbaren Form vorliegt, kann sehr komplex sein. Im einfachsten Fall wird für die Probenvorbereitung ein flüssiges Lösungsmittel verwendet, welches die Analyten aus der homogenisierten Probe heraus extrahiert. Um Kontamination des Analysengerätes zu vermeiden und niedrige Nachweisgrenzen zu erreichen, sind in der Regel weitere Aufreinigungsschritte notwendig. Hierzu zählen zum Beispiel die Filtration, die Festphasenextraktion (SPE) oder die Zentrifugation. Solche Probenvorbereitungsverfahren benötigen in der Regel eine große Menge an toxischen Lösungsmitteln. Alternativ dazu können sogenannte Mikroextraktionstechniken, wie zum Beispiel die SBSE [9], TF-SPME [10,11] oder SPME [12,13], verwendet werden. Ähnlich wie die Probenvorbereitungsmethoden für flüchtige Analyten, wie zum Beispiel die Headspace-Technik [14], Thermodesorption oder dynamische Headspace, kommen diese Methodiken mit wenig bis gar keinem organischen Lösungsmittel aus. Deswegen sind diese Verfahren umweltfreundlicher sowie kostengünstiger und verbessern zugleich die Arbeitssicherheit im Labor. 

Referenzen & Literaturempfehlungen 

K. Kaltenböck, Chromatographie für Dummies, 1. Auflage, Wiley-VCH, Weinheim, 2010. 

G. Schwedt, T. C. Schmidt, O. J. Schmitz, Analytische Chemie: Grundlagen, Methoden und Praxis, 3. Auflage, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, 2017. 

M. Otto, Analytische Chemie, 4. Auflage, Wiley-VCH, Weinheim, 2014. 

K. Cammann, Instrumentelle analytische Chemie: Verfahren, Anwendungen, Qualitätssicherung, 1. Auflage, Spektrum Akad. Verl., Heidelberg, 2010. 

S. Kromidas, Der HPLC-Experte: Möglichkeiten und Grenzen der modernen HPLC, Wiley-VCH, Weinheim, 2014. 

S. Kromidas, Der HPLC-Experte II: So nutze ich meine HPLC / UHPLC optimal!, Wiley-VCH, Weinheim, 2015. 

J. H. Gross, Massenspektrometrie: Ein Lehrbuch, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, 2012. 

M. Tswett, Adsorptionsanalyse und chromatographische Methode. Anwendung auf die Chemie des Chlorophylls, Berichte der deutschen botanischen Gesellschaft 24 (1906) 384. 

E. Baltussen, P. Sandra, F. David, C. Cramers, Stir bar sorptive extraction (SBSE), a novel extraction technique for aqueous samples: theory and principles, J. Micro. Sep.,11.10 (1999): 737-747. https://doi.org/10.1002/(SICI)1520-667X(1999)11:10<737::AID-MCS7>3.0.CO;2-4 

I. Bruheim, X. Liu, J. Pawliszyn, Thin-film microextraction, Anal. Chem. 75 (2003) 1002–1010. https://doi.org/10.1021/ac026162q. 

R. Jiang, J. Pawliszyn, Thin-film microextraction offers another geometry for solid-phase microextraction, TrAC Trends in Analytical Chemistry 39 (2012) 245–253. https://doi.org/10.1016/j.trac.2012.07.005. 

J. Pawliszyn, Handbook of Solid Phase Microextraction, Chemical Industry Press, Peking, 2009. 

C. L. Arthur, J. Pawliszyn, Solid phase microextraction with thermal desorption using fused silica optical fibers. Anal. Chem. 1990, 62, 19, 2145–2148. https://doi.org/10.1021/ac00218a019 

B. Kolb, L. S. Ettre, Static Headspace-Gas Chromatography: Theory and Practice, Wiley-VCH, New York, 1997.